Aunque desde hace tiempo se sabía que la microscopía electrónica tiene la capacidad teórica de resolver estructuras biológicas a resolución atómica, en la práctica problemas técnicos de diversa naturaleza habían impedido hasta muy recientemente que esta técnica fuera capaz de hacerlo de manera rutinaria. Los recientes ganadores del Premio Nobel de Química –Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson- son algunos de los científicos que más han contribuido a resolver estos problemas y a hacer que la criomicroscopía electrónica sea considerada como una de las técnicas estructurales más importantes y quizás la de mayor proyección.
Para que esto haya sido así, ha sido primero necesario resolver varios problemas, algunos de los cuales parecieron irresolubles en su momento. El primero era el mantenimiento de la muestra biológica bajo estudio en las condiciones más cercanas posibles a su entorno natural, esto es, que se encuentre hidratada. Esto no es posible hacerlo directamente en el microscopio, pues el agua se evaporaría por efecto del vacío de la columna y la muestra se destruiría. La genial idea del suizo Jacques Dubochet (entonces en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular EMBL, Heidelberg), a mediados de los 80, fue la de congelar la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido pero, a tal velocidad, que el agua de hidratación no pueda formar cristales de hielo. A este proceso se le llama vitrificación porque el agua congelada adquiere esa consistencia. Después de la vitrificación la muestra debe mantenerse siempre a temperatura de nitrógeno líquido, incluso durante su observación en el microscopio –es por eso que la técnica en su conjunto se llama criomicroscopía electrónica-, y es en este punto donde el británico Richard Henderson (en el Laboratory of Molecular Biology de Cambridge) realizó su primera contribución, pues estuvo involucrado en el diseño del aparataje necesario para tal fin.
A decir verdad, Henderson ya había realizado una contribución seminal en 1975 cuando en compañía de Nigel Unwin publicó la primera información estructural que probaba que la microscopía es capaz de revelar la estructura secundaria de una proteína – la bacteriorrodopsina-, en este caso de las alfa-hélices que forman su núcleo. Este trabajo, arduo y complejo, continuó durante otros quince años y sirvió para que Henderson pudiera publicar la primera estructura en tres dimensiones de una proteína –la misma bacteriorrodopsina- a resolución casi atómica (3,2 Å). Sin embargo, este y otros estudios que vinieron después tenían una fuerte limitación: para poder ser analizadas, las proteínas debían estar ordenadas en forma de cristales bidimensionales, es decir cristales que crecen en forma de una única lámina.
La necesidad de usar estos cristales era una clara limitación pues es muy complejo – y en muchas ocasiones imposible- conseguir que las proteínas cristalicen de esa manera. La idea obvia era intentar obtener información de las moléculas sin necesidad de tener que obtener cristales. El desarrollo de la metodología para reconstruir tridimensionalmente proteínas a partir de moléculas aisladas es la parte en la que el alemán nacionalizado americano Joachim Frank (trabajando fundamentalmente en el Wadsworth Centre de Albany, Nueva York) ha realizado la más importante contribución. A partir de esos desarrollos en los programas de procesamiento, él y otros consiguieron determinar estructuras, primero a resolución subnanométrica y después cercanas a la atómica, de algunos grandes complejos proteicos como ribosomas o virus icosaédricos. No obstante, esos eran casos poco frecuentes y accesibles sólo a investigadores de gran talento y medios, capaces de resolver multitud de problemas particulares asociados a cada muestra. La criomicroscopía electrónica estaba entonces lejos de ser una técnica rutinaria, sino que era más bien artesanal. Esto venía fundamentalmente motivado por dos problemas de carácter técnico. El primero y más importante es el problema de la radiación electrónica. Para obtener información la muestra debe ser iluminada en el microscopio con un haz de electrones de alta energía, pero eso causa daños irreversibles en la estructura de la proteína, lo que impide extraer la información de mayor resolución.
El único modo posible de resolver este problema es reducir la cantidad de electrones que iluminan la muestra. Desafortunadamente la placas fotográficas que se usaban en el pasado y los posteriores detectores CCD eran poco sensibles y no era posible reducir la dosis de electrones a los niveles adecuados. La revolución en la criomicroscopía electrónica se ha producido con el reciente desarrollo de los detectores directos de electrones –en cuyo diseño estuvo involucrado entre otros el propio Henderson-, basados en la tecnología CMOS (semiconductor complementario de óxido metálico). Estos detectores, además de requerir una muy pequeña dosis electrónica para registrar información relevante, son capaces de hacerlo de una manera muy rápida, de tal manera que en un segundo pueden registrar no una sola imagen sino decenas de ellas, y ha hecho que la información que se obtiene conserve incluso los detalles estructurales que permiten conseguir resolución atómica.
El segundo problema es que los programas de clasificación de las partículas y reconstrucción tridimensional no eran lo suficientemente buenos. Está fuera de este pequeño escrito extenderse en este punto, baste decir que la introducción de técnicas de máxima verosimilitud (“maximum likelihood”), realizadas entre otros en el grupo de nuestro compañero en el CNB José María Carazo y llevadas a su máximo nivel por Sjors Scheres (primero en el CNB y luego en el Laboratory of Molecular Biology) han permitido la reconstrucción tridimensional de pequeñas proteínas (p.ej. hemoglobina, 64 kDa) y grandes complejos macromoleculares a una resolución impensable hace sólo un lustro.
Estas dos mejoras han contribuido enormemente al salto de calidad de la criomicroscopía electrónica y a la “democratización” de la técnica – decenas de grupos por todo el mundo están realizando magníficos trabajos-. Lo más interesante si cabe es que hay espacio para que la tecnología mejore mucho más, no sólo con el desarrollo de mejores detectores de electrones, sino también con mejores sistemas ópticos y otras tecnologías como la placa de fase o el filtro de energía. El futuro no puede ser más prometedor.
Sin embargo no todo son buenas noticias. Uno de los problemas de esta técnica es el elevado precio de los criomicroscopios (hasta seis millones de euros), lo caro de su mantenimiento, y la necesidad de personal técnico muy especializado para su manejo. España cuenta con uno de estos nuevos criomicroscopios, en el servicio mixto de criomicroscopía CNB-CIB (CSIC), pero con seguridad la ciencia española requerirá de alguno más en un futuro muy próximo. En este aspecto, y desafortunadamente, la persistente falta de financiación no augura nada bueno.
